本作的前半部份发生于《生化危机2》之前，女主角吉尔于洋馆事件后，一直调查有关安布雷拉公司的地下业务。当时美国联邦政府决定以核弹彻底毁灭浣熊市，吉尔于是展开她的逃亡之旅。在逃亡期间，她受到安布雷拉公司欧洲分部派来浣熊市的生物武器追击者（Nemesis）追杀，并且遇上了隶属于Umbrella Biohazard Countermeasure Service（UBCS）的男主角卡洛斯，以及UBCS成员Mikhail Victor、Nicholai Ginovaef。吉尔及卡洛斯逃至市政府时，吉尔不幸受到追击者攻击而感染了T-病毒，于是卡洛斯便到安布雷拉公司旗下的附属医院寻找解药。

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